胰岛细胞内乳酸的排出决定胰岛素的分泌
朱承太编译
译者注：译者在糖尿病的研究过程中发现Department of Medicine, University of Manchester做的关于《乳酸对胰岛细胞的影响》(该论着发表在Biochem. J. (1989) 259, 507-511)的实验论着对于正确阐述糖尿病的发病机制极其有帮助。根据该实验得出的结论，甚至可以解释为什么糖尿病患者的胰岛素分泌出现异常。译者很奇怪为什么这篇文章的观点没有被学术界推崇，因为译者在糖尿病的研究中发现，该篇论着的观点可以解释任何与胰岛素相关的现象，而且甚至由此可以推导出“胰岛细胞缺氧导致糖尿病”的结论。
实验原文可以在本人的站点下载：
http://www.TaoPanacea.com/Archives/InsulinSecretion.pdf译文：
乳酸对胰岛细胞的影响——乳酸的排放可能是胰岛细胞去极化的决定因素
概要：实验利用两种办法刺激被灌注的老鼠的胰岛细胞，使之分泌胰岛素：1）葡萄糖浓度从5.6mM调高到20mM， 或者2）浸泡在在甲苯磺丁脲（即甲糖宁）溶液里。往5.6mM葡萄糖的溶液里加入40mM乳酸钠时，胰岛细胞表现出短暂的、小量的胰岛素分泌增加。接着，撤除乳酸——并没有撤除葡萄糖或者甲苯磺丁脲——导致明显的胰岛素分泌的增强。把胰岛细胞暴露在高浓度的葡萄糖、乳酸、或者甲苯磺丁脲时，以及跟着撤除乳酸的情况下，45Ca2+的流出量均出现增加。加入乳酸的时候，86Rb+的流出量受到了有限的抑制；但是把乳酸从胰岛细胞撤出的时候，86Rb+的流出量得到了明显的加强。培养在[U-14C]葡萄糖的胰岛细胞内[14C]乳酸的产量的增加与葡萄糖浓度（1mM~25mM）的增加线性相关。我们提出：乳酸的增加或撤出触发的胰岛细胞活化原因不在氧化物的增加；而是因为乳酸离子穿过质膜产生电势，并导致胰岛细胞的去极化现象，即Ca2+的流入和胰岛素的分泌。所以，酵解途径产生的乳酸、乳酸的排出、以及与此相伴的H+与Na+的交换可能是去极化的主要原因，也就是胰岛素分泌对葡萄糖的反应过程。
引言：
关于胰岛素的分泌，被认为质膜的去极化(Meissner & Schmelz, 1974)、Ca2+通过对电势敏感的Ca2+通道进入β细胞的过程决定(Satin & Cook, 1985; Findlay &Dunne, 1985)。后一个过程可以通过45Ca2+的吸收量的增加探知(Malaisse-Lagae & Malaisse，1971)，如从预装的胰岛细胞流出的Ca2+的刺激(Malaisse et al., 1973)，或细胞质里Ca2+浓度的增加(Deleers et al., 1985; Grappengeisser et al.,1988)。葡萄糖代谢是以上反应产生的前提，但是葡萄糖代谢与胰岛细胞去极化之间的机制尚不十分清楚。
有人提出葡萄糖氧化引起的胞液的PH值下降可能与胞液里代谢及离子活动有关系(Malaisse et al., 1980; Pace, 1984)。但是细胞内酸性化不能模仿葡萄糖对45Ca2+的作用，而且葡萄糖似乎不能降低胰岛细胞的PH值(Best et al., 1988a)。
最近，大量注意力集中到胰岛细胞质膜上受葡萄糖调解的K+通道，认为：葡萄糖氧化使胞液内ATP增加，并会通过抑制该通道、降低K+的渗透能力进行去极化(Cook & Hales,1984; Rorsman & Trube, 1985)。但是一些实验结果表明，K+通道机制不是调解胰岛细胞膜电势的唯一机制。
首先，葡萄糖引发的胰岛素分泌和ATP浓度之间没有明显的关联，在能够有效刺激胰岛素释放的葡萄糖的浓度范围之内，ATP的浓度没有变化或仅有有限的变化。(Hellman et al., 1969; Ashcroft et al., 1973; Malaisse & Sener, 1987)。
其次，对核苷敏感的K+通道被100μM ATP最大限度地抑制(Sturgess et al.1987)。同时， HCO3—也会阻止该通道(Carroll et al., 1988)。换句话说，K+通道在生理条件下几乎完全关闭。尽管K+通道能被ADP调控(Kakei et al., 1986)，而且该通道对ATP的高度敏感性可能与膜电势一致(Cook et al., 1988)，但仍有必要弄清楚葡萄糖刺激期间，腺苷酸的浓度的变化是否足够影响β细胞质膜的K+渗透性。
另外，高浓度葡萄糖导致膜电势的变化的过程中，K+渗透性所起的确切作用，目前存在疑问。实验观察到，糖的浓度大约在7~8mM时，葡萄糖对K+渗透性具有最大影响(Boschero & Malaisse, 1981)，但胰岛细胞的去极化和（胰岛素）分泌在20mM葡萄糖浓度区域最大(Meissner & Schmelz, 1974)。同时，葡萄糖浓度高出8.3mM会引起暂时性的（86Rb+）渗透性增长，而非降低(Boschero & Malaisse, 1981)，这可能是因为活化了对K+通道敏感的Ca2+的结果。最后用缬氨酶素阻止葡萄糖诱发的K+渗透性变化对Ca2+动员没有影响(Boschero et al., 1979)。
综上所述，所有观察表明额外的或者替代性的其他机制存在，该机制把葡萄糖代谢与胰岛细胞去极化偶联起来。我们的研究表明乳酸的形成，以及该阴离子从胰岛细胞的排出构成这种机制。
实验
1. 材料：125I-insulin, 45CaCl2, 86RbCl, D-[U-14]Glucose, [U-14C]Lactate, 以及[I-14]Pyruvate。
来自Radiochemical Centre, Amersham, Bucks., U.K.； Cambridge Biosciences, Cambridge, U.K提供Collagenase (Clostridium histolyticum)； Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, U.K.提供L-lactic acid。
2. 胰岛素分泌
胰岛细胞利用胶原酶消化法从250~300g体重的雄性或者雌性Wistar鼠分离而得(Lacy & Kostianovsky, 1967)。25个胰岛细胞为一组的多个组按照1ml/min的速度被灌注，灌注的溶液为Hepes-buffered重碳酸盐，包含1.5%牛血清(Yates & Gordon, 1982)，灌注液的胰岛素浓度利用放射性免疫测定法测得(Gordon et al., 1985)。培养液（乳酸钠、氯化钾）被用作添加物，取代氯化钠。
3. 放射性同位素排放实验
150个胰岛素为一组的多个组在200μl的培养液培养120分钟，包含2.5mM葡萄糖以及45CaCl2(30μCi)或86RbCl(15μCi)之中的一个。这些胰岛细胞用1ml未标记溶液清洗后，置于灌注室，以1ml/min的速度灌注。20分钟后，每隔1分钟收集一个样品，每个样品里添加4ml闪烁水溶胶（Aquasol scintillant）。利用液体闪烁计数测得放射能。结果用流出速率表示（即每分钟从胰岛细胞的丢失放射能与总放射能的比率）。
4. [U-14]Lactate，乳酸的生产
50个胰岛细胞为一组的多个组在100μl的溶液里培养，溶液包含10μCi的D-[U-14]Glucose(葡萄糖)和适量的未标记的糖。90分钟后，取25μl样品，用1ml水稀释，并上到包含0.5 ml Dowex AGIX8 (formate form)的柱子上。用20ml水把葡萄糖从柱子上洗下来，乳酸用3 x 2 ml的0.6M蚁酸洗提(Schadewaldt et al., 1984)。加入10ml闪烁水溶胶液之后，测量洗提液的14C含量。样品的大约95%的放射能在这部分洗提掉，该部分对应标准[U-14]Lactate、保留在柱子上的[I-14]Pyruvate。
结果：
葡萄糖从5.6提高到20mM造成显著的胰岛素分泌（图一）。相似地，把甲苯磺丁脲加到灌注液也导致了胰岛素释放的增加。增加40mM乳酸引起暂时的胰岛素分泌增加。但是接下来从灌注液撤出乳酸导致急剧的、两个阶段的、胰岛素释放速度的增加。撤出葡萄糖或者甲苯磺丁脲没有出现这种效果。在低浓度葡萄糖（2.5mM）的溶液里观察到乳酸的加入/撤出时，效果没有先前那么明显。
当葡萄糖的浓度增加到20mM的过程中，45Ca2+的流出量在开始阶段下降，然后上升（图2a）。甲苯磺丁脲导致45Ca2+流出量的立即增加（图2b）。加入乳酸到灌注了的胰岛细胞导致45Ca2+少量外流（图2c）。从灌注液撤出乳酸时，观察到显著的45Ca2+流出量的增加。撤出乳酸的效应在没有葡萄糖的情况下，仍继续；但在含有0.5 mM-EGTA、没加Ca2+的溶液里显著减少（图3）。
装载了86Rb+的胰岛细胞暴露到乳酸液时，这种放射性同位素流出速度出现少量降低，尤其葡萄糖浓度低的时候（图4）。这两种情况下，撤出乳酸都伴随86Rb+的外流的增加。
[U-14C] 葡萄糖酵解产生的[14C]乳酸的产量在120分钟的培养期间，线性相关。流到培养液的[14C]乳酸的量和 [U-14C] 葡萄糖的浓度，在1~25mM范围内线性相关（图5）。
讨论
现在流行的看法是，对应葡萄糖的胰岛素的分泌依赖糖的代谢。但是葡萄糖代谢过程中，决定电性、离子、以及胰岛细胞分泌行为的信号的本质尚未弄清楚。尽管一种看法认为线粒体内营养刺激物的氧化和核苷及ATP的变化参与了细胞内‘代谢信号’的生成(Malaisse et al.,1979a; Ozawa & Sand, 1986)，但是也有实验表明葡萄糖诱发的胰岛素分泌和45Ca2+摄取与胰岛细胞内酵解的速率紧密相关(Sener et al., 1976)。我们的研究表明，葡萄糖酵解为乳酸和乳酸从胰岛细胞排出可以是己糖激活胰岛细胞的关键的决定因素。以前已经注意到，乳酸很容易在胰岛细胞内代谢，却是很差的促分泌素(Malaisse et al., 1979b Lenzen & Panten, 1981)。当加入乳酸时， 45Ca2+流出和胰岛素分泌的短暂的激活，可能是乳酸氧化的结果，或者是穿越质膜的乳酸运输的结果。后一种被认为在许多组织里依赖H+(Spencer & Lehninger, 1976;
Jennings & Adams-Lackey, 1982; Fafournoux et al，1985）。而且我们观察到，乳酸的加入会导致分泌胰岛素的细胞胞液的pH（pHi）值下降（J.E. Meats, unpublished work），这与乳酸-质子协同运输相符。pHi的下降可以解释胰岛素分泌的增加和86Rb+流出速率的降低(Best et al., 1988a,b)。另一种可能是，乳酸进入胰岛细胞内依靠电中和机制，比如质子协同运输，以及随后发生的去极化现象，它是乳酸通过公认的通道从细胞流出的结果。这种机制可以解释培养在提高了浓度的乳酸里培养的Lettre细胞递进性去极化现象(Bashford & Pasternak, 1984)，并被我们最近的发现证实分泌胰岛素的HIT细胞短暂地被乳酸去极化，这一点用oxonol-V fluorescence和直接测量质膜的电势进行评估(J. E. Meats & M. D. Tuersley, unpublished work)。
乳酸的排放在调节胰岛细胞质膜电势方面的重要性表现在从灌注液撤出乳酸时引起的反应和提高葡萄糖浓度时引起的反应品质上相似。很清楚，撤出乳酸的效应很可能比代谢量的增加或者胞液pH值的减少重要。通过K+渗透性效应去极化的可能可以被排出，因为乳酸的撤出不仅不减少86Rb+的渗透性，反而会增加。这可能是打开了Ca2+或者依赖电势的K+通道的结果(Matthews & Shotton, 1984)。撤出乳酸激活胰岛细胞的最简单的解释是，从培养液撤出乳酸使得胰岛细胞内的乳酸离子通过公认的渠道迅速、大量地流出。进一步说，乳酸从胰岛β细胞的流出可能是葡萄糖激活胰岛细胞的决定因素。这一机制可以解释葡萄糖酵解速度和胰岛素释放之间存在的密切的关联(Seneret al., 1976)。
可以认为细胞内质子的聚集会引发反作用，把质子逐出细胞以换取Na+离子。乳酸通过这种机制的流出会导致细胞内负电荷的净损失，这在理论上可以造成质膜的去极化，并导致对电势敏感的Ca2+通道的开放，于是Ca2+进入细胞内。
值得注意的是，乳酸的形成、并从胰岛细胞流入培养液与葡萄糖浓度（1~25mM）的提高线性关联。因此，乳酸从胰岛β细胞流出应该是葡萄糖浓度的提高激活胰岛细胞的过程中的偶联机制。这个观点并不否认受ATP调节的K+通道对胰岛β细胞质膜电势调制作用（Cook et at., 1988)。当然可能还有别的机制在葡萄糖浓度的其他范围对质膜的电势进行调整。
总之，我们演示了乳酸对胰岛细胞的全新作用，结果表明乳酸穿越质膜是形成膜电势的决定因素。这个机制是否参与了葡萄糖诱发的胰岛细胞去极化还有待对乳酸的进一步研究，如乳酸在胰岛细胞内生成和排出方面的修改，以及这些效应对葡萄糖激活胰岛细胞方面的影响。
本次实验由医学研究委员会和西北地区的健康当局资助。我们感谢在实验过程中与Dr. C. L. Bashford进行的讨论，同时还感谢与Dr. A. M. Lynch进行的讨论以及他对手稿的评价。
