无水乙醇提取全血细胞DNA1、取2毫升外周静脉血,加入ACD抗凝剂100微升,混合均匀。血液尽量新鲜,在冰箱内存放不要超过5天,以保证DNA分子的完整性------制备抗凝血
2、加300微升抗凝血于1.5毫升ep管中。加入900微升红细胞裂解液,反复颠倒混合均匀,室温放置10分钟,其间再颠倒3-5次----将充分红细胞裂解。为后面分离有核细胞做准备。
3、室温15000转离心20秒,使有核细胞沉淀ep管底部。----红细胞由于裂解后变轻,经离心后会进入上清液。
4、吸去上清液,加红细胞裂解液900微升,混合均匀,重复离心,弃上清。---使红细胞残留彻底与有核细胞分离
5、加30微升的红细胞裂解液将白细胞制成制成细胞悬液。-----将白细胞团打散为后面的裂解做准备。
6、加300微升的白细胞裂解液,充分混合均匀。室温下放置10分钟,直至白细胞完全裂解(溶液变粘稠)---其中主要是蛋白质的缘故。
7、加入100微升蛋白沉淀液,强力震荡使之充分混合均匀。---是蛋白质沉淀
8、15000转载离心机中10分钟,蛋白质沉到ep管的底部形成紧密地深棕色斑块。---分离蛋白质,其他成分进入上清液
9、将上清液移至另一新的1.5ml ep管中,加入900微升预冷无水乙醇,放置3分钟,然后反复轻轻颠倒ep管,直至DNA沉淀完全析出。-----关键步骤。注意加无水乙醇时要掌握好方法,使无水乙醇与上清液形成一个界面。在界面冒气泡上形成丝状物后,在轻摇,力度太大会将DNA晃散。
10(a)再次离心5分钟,将DNA沉底到管壁,倒掉液体后,用70%酒精进行清洗,去除高盐。倒掉酒精后用50微升的te液固定。4摄氏度冰箱保存备用。
10(b)可以用玻璃钩将DNA勾出后用70%酒精进行清洗团块,晾干后加入到50微升的te液进行固定,4摄氏度冰箱保存备用。
注意:实验的关键步骤是第9步。此方法比氯仿异戊醇提取麻烦,但适合用于高质量要求的DNA提取.