西安交通大学医学院教案
课程名称机能实验学 授课方式_________
任课教研室_________ 任课教师_________
授课年级_________ 授课时间_________
目的要求
学习离体蛙心灌流的实验方法,了解离体器官的研究方法.
掌握各种理化因素对心脏活动的影响机制.
进一步熟悉和掌握生物信号采集和处理系统.
内容
1. 制备离体蛙心灌流模型;
2. 观察各种理化因素对心脏活动的影响.
重点与难点
制备离体蛙心灌流模型;
具体安排
时间分配
实验原理讲解30分钟;示教20分钟;学生操作140分钟;小结10分钟
教 具
蛙类手术器械一套
教学后记
离子和药物对离体蛙心的影响
【实验目的】
1.学习离体蛙心灌流的实验方法,了解离体器官的研究方法.
2.掌握各种理化因素对心脏活动的影响机制.
3.进一步熟悉和掌握生物信号采集和处理系统.
【实验原理】
心脏正常的节律性活动必须在适宜的理化环境中进行,一旦适宜的环境被破坏,例如酸碱度及离子浓度的急剧改变等,心脏的活动就会受到影响.在整体内,心脏的活动受自主神经的双重支配,交感神经兴奋时,其末梢释放去甲肾上腺素,使心肌收缩力量增强,心率加快;而迷走神经兴奋时,其末梢释放乙酰胆碱,使心肌收缩力量减弱,心率减慢.强心甙类药物能够增强心肌收缩能力,减慢心率.
蟾蜍心脏离体后,用理化特性近似于血浆的Ringer氏液灌流,在一定时间内,可保持其比较稳定的节律性收缩和舒张.改变Ringer氏液的组成成分,如改变Na+、K+、Ca2+ 的浓度及酸、碱度等,心脏跳动的频率和幅度就会发生相应的改变.
K+对心脏活动的影响:
总体看来心脏对细胞外K+浓度变化比较敏感;但不同部位心肌的敏感性不同,心房肌最敏感,房室束-浦肯野纤维系统次之,窦房结敏感性较低.
细胞外[K+]↑时,对兴奋性的影响与其浓度升高的程度有关.当[K+]轻度或中度升高时,细胞内外[K+]梯度减小,K+外流力量减小,静息电位(RP)的绝对值减小,和阈电位(TP)的差值减小,细胞的兴奋性升高;当[K+]大幅度升高时, RP的绝对值减小到-55mv时,钠通道的开放效率降低,钠通道逐渐失活,细胞的兴奋性降低或丧失,严重时,可导致心肌停搏于舒张状态.此时,仅由Ca2+来构成动作电位,故上升支小而缓慢,使兴奋传导性降低.
当细胞外[K+]↑时,细胞膜对钾的通透性升高,心室肌细胞复极过程加速,平台期缩短,不应期也缩短.
高钾对心肌收缩功能有抑制作用.因为细胞外的钾和钙在细胞膜上有竞争性抑制,因此当膜外[K+]↑时,平台期内流的Ca2+减少,心肌细胞内的Ca2+浓度难于升高,减小了Ca2+的兴奋-收缩偶联作用,从而减低了心肌的收缩能力.
4期自动除极速度减慢,导致窦房结自律性降低,心律减慢.
Ca2+对心脏活动的影响:
细胞外Ca2+在心肌细胞膜上对Na+的内流有竞争性的抑制作用,称为膜屏障作用.因此,细胞外Ca2+浓度发生变化时,与Na+的内流和Ca2+的内流相关的电活动都将受到影响,而对静息电位则无明显作用.
当细胞外Ca2+浓度↑时,对Na+的屏障作用↑,由于这种抑制作用,触发Na+快速内流产生0期去极化就比较困难,即TP上移,从而与RP的差距增大,兴奋性降低;发生兴奋后,Na+内流的抑制则导致0期去极化速度和幅度降低,传导性下降.
Ca2+内流是慢反应细胞0期去极化和快反应细胞2期的主要离子活动.当细胞外Ca2+浓度↑,使Ca2+内流加快,慢反应细胞0期去极化加快加强,传导性升高.
细胞膜对Ca2+的通透性升高,心室肌细胞平台期Ca2+内流增加,心肌收缩力增强增快;当细胞外Ca2+浓度过高时,心脏将停搏于收缩状态,称为钙僵直.
去甲肾上腺素对心脏活动的影响:
去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的β肾上腺素能受体结合,激活腺苷酸环化酶(AC),使细胞内cAMP浓度升高,激活PKA和细胞内的蛋白质磷酸化过程,使心肌细胞膜上的钙通道激活,动作电位平台期Ca2+内流增加,心肌收缩力增强;另外去甲肾上腺素能加强4期的内向电流If,使心率加快.
乙酰胆碱对心脏活动的影响:
乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M型胆碱能受体结合,抑制AC,细胞内cAMP浓度降低,肌浆网释放的Ca2+减少,心肌的收缩力量减弱,心率减慢.乙酰胆碱与窦房结细胞膜上的Ikach通道结合,促进K+的外流,最大复极电位增大,自律性降低,此外还抑制4期的内向电流If,使心率减慢.
0.65%NaCl对心脏活动的影响:
0.65%NaCl对蟾蜍来说使等渗溶液,完全置换任氏液后,细胞外的Ca2+浓度,K+浓度大大降低,使心肌的收缩能力减弱,心率减慢.
3%乳酸对心脏活动的影响:
乳酸的PH值较低,当加入乳酸后,细胞外H+浓度升高,H+和Ca2+离子竞争性结合肌钙蛋白的结合位点,抑制Ca2+离子与肌钙蛋白结合,心肌收缩力量减弱.当再加入2.5%NaHCO3后,解除了H+对Ca2+离子的竞争性作用,Ca2+离子又可与肌钙蛋白结合,心肌收缩力量恢复.
【实验材料】
1. 动物: 蟾蜍.
2. 试剂和药品: Ringer氏液, 0.65%NaCl,1%KCl,2%CaCl2,3%乳酸,2.5%NaHCO3,1：10,000去甲肾上腺素,1：100,000乙酰胆碱,.
3. 装置和器材: 铁支架,双凹夹,蛙心杠杆,蛙心套管,蛙心夹,蛙板,蛙手术器械,滴管(2支),棉线,张力换能器,计算机及生物信号采集处理系统.
【实验方法】
1. 破坏蟾蜍脑和脊髓, 暴露心脏.
2. 在主动脉左侧分支下穿两根线,右侧分支下穿一根线,动脉主干下穿一根线备用.先结扎动脉干右侧分支,再用玻璃针将心脏翻至背面,在静脉窦以外结扎前后腔静脉(注意勿扎住静脉窦).将心脏翻至腹面结扎动脉干左侧分支远端,然后用眼科剪刀在左侧分支近心端剪一斜口.取一蛙心套管,注入适量Ringer氏液于管内,用右手拇指堵住套管外口,食指和无名指夹持蛙心套管,用左手提起动脉干左侧分支远端结扎线,将蛙心套管的尖端自斜口插入动脉腔内,插至动脉圆锥时略向后退,在心室收缩时,沿心室后壁方向向下插入心室.插管进入心室后,管内液面会随着心室跳动而上下波动.最后用近心端备用线结扎并固定蛙心套管和动脉管壁,并将结扎线固定于套管侧壁的小突起上. 提起套管,在结扎线远心端分别剪断动脉干左、右侧分支和前、后腔静脉,将心脏离体.随即用Ringer氏液反复换洗套管内液体至完全澄清.用双凹夹将蛙心套管固定于铁支架上备用.在心室舒张时,用蛙心夹夹住心尖约1毫米,将蛙心夹上的棉线向下绕过滑轮,并且向上连接到张力换能器上,再将张力换能器连接到计算机的相应接口.启动计算机并开启生物信号采集处理系统.
3. 对于BL-410生物信号采集与处理系统:在菜单命令选项中选择循环实验→蛙心灌流实验,用已确定好的实验程序即可进行实验.一旦选定,会有相应的参数设定对话框出现,根据实验要求设定所需参数.观察正常的心脏收缩曲线.
4. 对于chart4.12生物信号采集与处理系统:
① 打开所有仪器电源,将4ST与计算机主机相连;
② 将张力换能器连接到4ST前面板的第一通道连接口上,双击桌面上chart图标进入相应的窗口;
③ 点setup菜单命令中的channel settings 设置实验所需的通道数1个,信号的名称,点击OK,即可进入设置好的通道信号.
④ 下拉相应的通道菜单,点击Bridge Pod ,会出现Bridge Pod窗口,在窗口中分别选择幅度参数Range为2～5mv,10*gain(√),offset(√),滤波参数为(50～100Hz),然后用Bridge Pod旋钮调整基线到零,用一个砝码进行定标.单位转化(unit conversion):点击units,选择g,小数点后的位数等.点击窗口中的0基线,其电压值可送入Point1的电压值框内,后边的框内输入0.000;点击窗口中加砝码后基线,其电压值可送入Point2的电压值框口,后面的框内输入相应的砝码值;点击Apply,OK,返回到Bridge Pod窗口,点击OK,即可进行张力信号的记录.(将曲线压缩到5:1,效果较好)
5.观察项目
① 描记正常心脏收缩曲线:曲线幅度代表心室收缩的强弱,单位时间内的曲线个数代表心跳频率.曲线向上移动表示心室收缩,其顶点水平代表心室收缩所达到的最大程度;曲线向下移动表示心室舒张,其最低点即基线水平代表心室舒张的最大程度.
② 吸出插管内全部Ringer氏液,换入0.65%NaCl, 观察心搏曲线变化,待效应出现后,用新鲜Ringer氏液反复换洗直至心搏曲线恢复正常.
③ 加入1～2滴2% CaCl2于Ringer氏液中,观察心搏曲线的变化,待效应出现后,用新鲜Ringer氏液反复换洗至曲线恢复正常.
④ 加入1～2滴1%KCl于Ringer氏液中,观察心搏曲线的变化,待效应刚出现时,立即用新鲜Ringer氏液反复换洗直至心搏曲线恢复正常.
⑤ 加入1～2滴1：10,000去甲肾上腺素,观察心搏曲线的变化,待效应出现后,用新鲜Ringer氏液反复换洗直至心搏曲线恢复正常.
⑥ 加入1滴1：10,000的乙酰胆碱,观察心搏曲线的变化,待效应刚出现时,立即用新鲜Ringer氏液反复换洗直至心搏曲线恢复正常.
⑦ 加入1滴3%乳酸,观察心搏曲线的变化,待效应出现后,加入1滴2.5%NaHCO3, 再观察心搏曲线的变化,至心搏曲线基本恢复时,再用新鲜Ringer氏液反复换洗直至心搏曲线恢复正常.
将上述实验所得心搏曲线进行标记,以便分析、讨论.
【注意事项】
1.从第②项实验开始,每项实验都应有前后对照.
2.加药物时,先加入1～2滴,如作用不明显时可再补加.
3.换洗时不要让空气进入心室.
4.连接蛙心夹和张力换能器的棉线松紧度要合适.
5.做每项实验时,都要在实验结果上作标记,以免混淆.
6.随时滴加Ringer氏液于心脏表面使其保持湿润.
7.当每种化学药物(尤其是抑制心脏活动的药物)作用已明显时,应立即换洗,以免心肌受损.反复用任氏液换洗数次,待心跳恢复正常后再进行下一步实验.
8. 做每项实验时均应保持套管内的液面在相同高度.
【讨论思考】
1. 实验过程中蛙心套管内的灌流液面为什么都应保持相同的高度
2. 决定和影响心肌内环境稳态的主要理化因素是什么 为什么
3. 蛙心灌流实验对你有何启发
【讨论思考题答案】
1. 实验过程中蛙心套管内的灌流液面都应保持相同的高度,因为蛙心套管内的灌流液体形成的压力对蛙心来说既是前负荷又是后负荷,而不论是前负荷还是后负荷都可以影响心肌的收缩活动.为了使每次结果具有可比性,应该使蛙心套管内的灌流液面保持相同的高度.
2. 决定和影响心肌内环境稳态的主要理化因素是Na+、K+、Ca2+ 的浓度,酸、碱度,去甲肾上腺素和乙酰胆碱等可以影响心肌细胞动作电位和收缩的物质.详见实验原理.
蛙心灌流实验对我们的启发是,内环境稳态的维持对心肌正常生理功能的维持是非常重要的.
【教学要求】
知识点:1.心肌细胞动作电位的产生过程.
(1)去极化过程—0期
MP:-90 ( +30 mV; t: 1 ms
机制:→部分Na+通道开放→ Na+少量内流→膜去极化,MP↓→TP→ Na+通道大量开放→再生性Na+内流(INa)→MP↓↓(快)→0→ +30 mV (Ena)
(2)复极化过程(1 ( 4期;t:300 ( 400 ms)
1)1期 MP:+30 ( 0 mV; t: 10 ms
机制:一过性K+外流→Ito(transient outward current)→MP变化. 受Cl-影响.
2)2期—平台期(AP的主要特点) MP:0 ( mV; t: 100 ( 150 ms
机制:
① L型Ca2+通道已开放→内流; 少量Na+→ ….
TP: -30 ( 40 mV; 2期末关闭;阻断剂:Mn2+
维拉帕米;对TTX及持续去极化(-50 mV)不敏感
② T型Ca2+通道+ → Ca2+内流→….
TP:-50 ( -60 mV
③ IK通道+ →K+外流→ … . 2期末↓
TP:+20 mV; 失活:-40 ( -50 mV
④ IK1通道+ →K+外流→ … . 2期末↑
阻断剂:Ba2+,Cs+
3)3期 MP:0 ( 90 mV; t: 100 ( 150 ms
机制: IK1通道+ →K +外流→ … .
当TMP→-20 ( -60 mV时, IK1↑,呈正反馈
4)4期(恢复期) MP:-90 mV;
① IK1;
② Na+-K +泵 →主动转运Na + -K + (3∶2);
泵电流,消耗能量—ATP;
③Na+-Ca2+交换体 → Na+-Ca2+交换(3 ∶ 1),交换电流.
2.实验原理.
操作重点:1,学会离体蛙新模型的植被;2,学会离体蛙心实验的方法.
